ایمن سازی
ایمن سازی برای ارائه یک آنتی ژن به شکل مناسب برای القای شدیدترین پاسخ ایمنی هومورال به حیوان ضروری است. این مرحله ضروری منجر به تولید سلول هایی می شود که آنتی بادی علیه آنتی ژن انتخابی شما ترشح می کنند.
روز اول
- آنتی ژن را در 150 میکرولیتر تا 200 میکرولیتر PBS استریل برای هر حیوان رقیق کنید.
- آنتی ژن را با 150 میکرولیتر تا 200 میکرولیتر از ادجوانت مخلوط کنید (پیوست D را ببینید).
- اگر در اروپا کار می کنید، دو موش ماده BALB/c را به صورت داخل صفاقی یا اگر در بریتانیا کار می کنید به صورت زیر جلدی تزریق کنید (به پیوست A مراجعه کنید).
روز دهم تا پانزدهم
- تزریق را تکرار کنید.
روز بیستم تا سی
- تزریق این بار باید حاوی آنتی ژن فقط در PBS استریل باشد (بدون ادجوانت). این تزریق می تواند به صورت داخل صفاقی یا زیر جلدی انجام شود، چه در اروپا و چه در انگلستان کار کنید.
روز سی یا چهل
- یک خونریزی دم از موش های واکسینه شده جمع آوری کنید.
- اجازه دهید خون لخته شود.
- رقت های سریالی از سرم حاصل را در PBS انجام دهید.
- نمونه های سرم موش را با روش الایزا در برابر آنتی ژن و/یا تکنیک رنگ آمیزی دیگر آزمایش کنید. نتایج باید با نتایج به دست آمده با استفاده از رقت مشابه سرم معمولی موش مقایسه شود. این مرحله به شما امکان می دهد بررسی کنید که آیا حیوانات آنتی ژن را تشخیص داده اند و تشخیص دهید که کدام موش بهترین پاسخ ایمنی را دارد.
- حداقل 3 هفته بین تزریق سوم و تقویت آنتی ژن نهایی قبل از انجام فیوژن فاصله بگذارید.
- بوست نهایی را به صورت داخل وریدی (به ضمیمه C مراجعه کنید) یا داخل صفاقی سه یا چهار روز قبل از روز فیوژن تزریق کنید.
- این تقویت نهایی می تواند حاوی 100-200 میکروگرم آنتی ژن رقیق شده در 150 میکرولیتر PBS استریل باشد.
- سه تا چهار روز پس از تقویت نهایی، باید موش را قربانی کنید، طحال را به صورت آسپتیک بردارید و در ظرف استریل حاوی 5 میلی لیتر محیط قرار دهید.
- تکنیک فیوژن را ادامه دهید.
NB حیوانات سالم و مراقبت شده برای به دست آوردن پاسخ آنتی بادی خوب ضروری هستند.
کاملاً ضروری است که آموزش صحیح طبق مقررات کشور مربوطه برای هر روشی که شامل حیوانات می شود به طور رضایت بخش تکمیل شود. علاوه بر آموزش، تزریق و خونریزی حیوانات به صورت ایمن و بدون درد نیاز به مهارت و صبر دارد.
پیوست اول
تزریق داخل صفاقی
غلظت آنتی ژن باید بین 50-100 میکروگرم در هر موش باشد. حجم تزریقی نباید بیش از 300 میکرولیتر در هر ماوس باشد.
روش زیر برای دو موش است:
- آنتی ژن باید در حدود 300 میکرولیتر PBS رقیق شود و با 300 میکرولیتر ادجوانت در یک لوله اپندورف مخلوط شود.
- اپندورف را گرداب کنید تا ادجوانت دوباره معلق شود و امولسیون بین آنتی ژن آبی و ادجوانت مبتنی بر روغن تشکیل شود. محلول باید در این مرحله یکنواخت سفید و بدون جدا شدن به دو لایه باشد.
- محلول را داخل سرنگ 1.0 میلی لیتری بکشید.
- یک سوزن گیج 23 یا 25 روی سرنگ قرار دهید.
- هر حباب هوای موجود در لوله سرنگ یا سوزن را با فشار دادن دقیق پیستون تا زمانی که امولسیون به سوزن برسد جابجا کنید.
- با استفاده از یک دست ماوس را محکم نگه دارید و با دست دیگر امولسیون آنتی ژن کمکی را با دقت به داخل حفره صفاقی تزریق کنید.
- توجه: همه ادجوانت ها به طور بالقوه مضر هستند. در هنگام تهیه و تزریق آنتی ژن مراقب باشید.
- حیوان را به قفس خود برگردانید و به مدت پنج دقیقه با هم بمانید تا مطمئن شوید که همه چیز خوب است.
ضمیمه B
تزریق زیر جلدی
غلظت آنتی ژن باید بین 50-100 میکروگرم در هر موش باشد. حجم تزریقی نباید بیشتر از 300 میکرولیتر باشد.
روش زیر برای 2 موش است:
- آنتی ژن باید در حدود 300 میکرولیتر PBS رقیق شود و با 300 میکرولیتر ادجوانت در یک لوله اپندورف مخلوط شود.
- اپندورف را گرداب کنید تا ادجوانت دوباره معلق شود و امولسیون بین آنتی ژن آبی و ادجوانت مبتنی بر روغن تشکیل شود. محلول باید در این مرحله یکنواخت سفید و بدون جدا شدن به دو لایه باشد.
- محلول را داخل سرنگ 1.0 میلی لیتری بکشید.
- یک سوزن گیج 23 یا 25 را روی سرنگ قرار دهید.
- با فشار دادن دقیق پیستون تا زمانی که امولسیون به سوزن برسد، هوا را در بشکه سرنگ یا سوزن جابه جا کنید.
- موس را با یک دست محکم نگه دارید و با دست دیگر امولسیون آنتی ژن کمکی را بین پوست و حفره صفاقی با دقت تزریق کنید، از داخل حفره صفاقی عبور نکنید.
- BB همه ادجوانت ها بالقوه مضر هستند. در هنگام تهیه و تزریق آنتی ژن مراقب باشید.
- حیوان را به قفس خود برگردانید و به مدت پنج دقیقه مراقب باشید تا مطمئن شوید که همه چیز خوب است.
پیوست ج
غلظت آنتی ژن باید بین 50-100 میکروگرم در هر موش باشد و فقط در PBS استریل رقیق شود. هیچ کمکی نباید استفاده شود.
حجم تزریقی نباید بیش از 300 میکرولیتر در هر ماوس باشد.
تزریق داخل وریدی
- موش را در یک قفس یا ظرف کوچک جدا کنید.
- ماوس را با یک لامپ مادون قرمز گرم کنید. این کار خون رسانی به دم را افزایش می دهد، رگ ها را بزرگ می کند و مکان یابی و تزریق آن ها را آسان تر می کند. رگهای دم باید به راحتی قابل مشاهده باشند.
NB مراقب مدت زمانی که ماوس زیر لامپ می ماند باشید. اگر دما برای دست شما خیلی گرم است، پس برای ماوس خیلی گرم است.
- قسمتی از دم را حدود 1.5 سانتی متر زیر پایه دم با الکل بمالید.
- با فشار دادن دقیق پیستون تا زمانی که امولسیون به سوزن برسد، هوا را در بشکه سرنگ یا سوزن جابه جا کنید. توجه: این مرحله برای جلوگیری از بروز آمبولی هوای کشنده در موش ضروری است.
- یک سوزن گیج 26 یا 27 را روی یک سرنگ 1.0 میلی لیتری قرار دهید.
- دم را با یک دست محکم بگیرید و سوزن را به داخل یکی از رگ ها هدایت کنید.
- اطمینان حاصل کنید که سوزن داخل رگ است، تزریق را به آرامی انجام دهید.
- چند ثانیه مکث کنید.
- سوزن را بردارید و موس را به قفسش برگردانید.
- برای اطمینان از اینکه همه چیز خوب است، ماوس را به مدت پنج دقیقه مشاهده کنید.
ضمیمه D
کمکی ها
دو ادجوانت اصلی که استفاده می کنیم عبارتند از ادجوانت فروند (کامل یا ناقص) (BD Difco 263810 و BD Difco 263910) و طلای Titremax (Sigma T2684).
هر دو در ایجاد پاسخ ایمنی بسیار خوب هستند.
ادجوانت فروند
کمک کامل فروند (CFA)
CFA یک روغن معدنی است که حاوی سوسپانسیونی از مایکوباکتریوم های کامل یا پودر شده با حرارت کشته شده است. هنگامی که با محلولی از آنتی ژن مورد نظر امولسیون می شود تا یک امولسیون آب در روغن تشکیل شود، CFA در تقویت پاسخ های ایمنی سلولی و هومورال به آنتی ژن تزریقی موثر است. فعالیت کمکی آن در نتیجه آزادسازی مداوم آنتی ژن ها از امولسیون روغنی و تحریک یک پاسخ ایمنی ذاتی محلی است که منجر به افزایش ایمنی تطبیقی می شود. یکی از اجزای ضروری این پاسخ یک واکنش التهابی شدید در محل رسوب آنتی ژن است که در نتیجه هجوم لکوسیت ها و تعامل آنها با آنتی ژن ها ایجاد می شود.
کمکی ناقص فروند (IFA)
برای اکثر کاربردها، CFA معمولاً فقط برای ایمن سازی اولیه ضروری است، در حالی که ادجوانت فروند ناقص (IFA)، که فاقد مایکوباکتری است، ادجوانت انتخابی برای ایمن سازی های بعدی است.
طلای تیترمکس
TitreMax Gold یک ادجوانت جدید و بهبود یافته آب در روغن است. TitreMax Gold Adjuvant شامل سه ماده ضروری است: یک بلوک کوپلیمر (CRL-8300)، اسکوالن (روغن قابل سوخت و ساز)، و یک تثبیت کننده ریز ذرات منحصر به فرد. مخصوصاً با اسکوالن برای تولید امولسیون های آب در روغن پایدار فرموله شده است. امولسیون کردن آن بسیار راحت تر از ادجوانت فروند است. امولسیون به دست آمده چسبناک کمتری دارد و تزریق آن را از طریق سوزن های کوچک آسان می کند. به نظر می رسد که TitreMax Gold کمتر سمی است و به اندازه سایر کمک های کمکی موثر است.
